甲型病毒和许多其他节肢动物传播的病毒一样，感染脊椎动物物种和昆虫媒介，这些物种和昆虫的进化历史相隔数亿年。病毒通过识别不同物种中不同的细胞受体，或与跨物种高度保守的受体结合（比如载脂蛋白受体），进入进化上差异很大的宿主细胞。虽然已经描述了多种甲型病毒受体，但大多数在脊椎动物和无脊椎动物宿主中并不共享。
2021年12月21日发表在《Nature》的一项标题为“VLDLRandApoER2arereceptorsformultiplealphaviruses”的研究中，作者发现极低密度脂蛋白受体(VLDLR)是典型的甲型病毒塞姆利基森林病毒（SemlikiForestVirus，SFV)的受体，SFV、东方马脑炎(easternequineencephalitis，EEEV)和辛德毕斯(Sindbis，SINV)病毒的E2/E1糖蛋白与VLDLR的配体结合域(LBD)、密切相关的受体载脂蛋白E受体2(ApoER2)相互作用介导病毒进入细胞。并认为，一些甲型病毒感染多种宿主的能力是因为他们能与不同物种的载脂蛋白受体结合。
甲型病毒是包膜RNA病毒，可引起症状从皮疹、关节痛、急性发热疾病到致命的脑炎。它们的基因组编码四种非结构蛋白和结构蛋白衣壳以及E3-E2-6K/TF-E1。病毒包膜蛋白以二十面体对称排列，E2和E1糖蛋白形成异质二聚体，聚成80个三聚体，介导病毒和细胞膜的受体结合和融合。为了使用系统忠实地模仿E2/E1的编排,作者将甲型病毒复制子系统转化为基于DNA的报告病毒颗粒(RVP)系统，其中一个质粒编码异源E3-E2-6K/TF-E1蛋白，另一个质粒编码罗斯河病毒(RoseRivervirus，RRV)非结构蛋白衣壳和一个报告基因。还生成了一个针对人类基因组中膜相关蛋白的引导RNA(sgRNAs)文库。使用该文库对感染SFVRVPs的HEK293T-Cas9细胞进行CRISPR/Cas9筛选。VLDLR是测序数据分析的首选(图1a)。
针对重组人热激蛋白90β-1（HSP90B1）和STT3A的引导RNA也得到了富集(图1a)。HSP90B1编码内质网(ER)驻留的伴侣蛋白，与蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型丝氨酸蛋白酶(PCSK9)结合，阻止PCSK9诱导LDLR家族成员变性。STT3A编码N-寡糖转移酶(OST)复合体的催化亚单位，也参与黄病毒的细胞感染，黄病毒是另一类节肢动物传播的病毒，与甲型病毒一样，携带正义RNA基因。STT3A通过与病毒非结构蛋白结合，在黄病毒RNA复制中发挥作用。因此，在作者的筛查中，STT3A的基因中断可能影响了通过RVP系统的RRV成分的复制。
与其他LDLR家族成员一样，VLDLR含有一个富含半胱氨酸重复序列(LDLRA(LA)重复序列)的N-末端LBD，一个含有β-螺旋体结构域的表皮生长因子模块簇，以及一个膜近端的O-连接糖域(图2c)。缺失EGF模块/β-螺旋体结构域可以导致SFVRVP感染，但LBD结构缺失不支持SFVRVP感染(图2c)，进一步支持LBD作为E2/E1附着位点的作用的是，一个VLDLRLBD-Fc融合蛋白(VLDLRLBD-Fc)抑制HEK293T细胞的SFVRVP感染(图2e)。
接下来，作者试图确定其他甲型病毒是否可以结合人类VLDLR进入细胞。结果显示，在细胞中，SINV、EEEV、委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequineencephalitis，VEEV)、西部马脑炎(westernequineencephalitis，WEEV)或CHIKVRVP的感染没有减少。抗VLDLR抗体只阻止SFVRVP进入Vero细胞，而对作者测试的其他甲型病毒没有影响。LDLR、VLDLR和ApoER2高度保守，具有可重叠的结构，表明它们的相应基因是从单一祖先进化而来的。ApoER2和VLDLR在脑发育中起关键作用，并调节14-16岁的突触可塑性。ApoER2在大脑中丰富，可以经历大量的选择性剪接事件，改变其LA重复数和配体结合特性。作者克隆了一个包含7个可能LA重复的ApoER2亚型(LA1-7，这里称为ApoER2iso1)和另一个只包含3个重复的ApoER2iso2亚型(LA1-3,ApoER2iso2)，结果表明VLDLR在细胞表达缺乏，而没有检测到K562细胞上ApoER2的表达，只检测到LDLR的表达。SFV、EEEV和SINVRVPs不同程度地感染经VLDLR或ApoER2亚型转导的K562细胞。证实感染是异位脂蛋白受体表达的结果，加入RAP或不含Fc片段的可溶性VLDLRLBD(sVLDLRLBD)蛋白，阻断了E2/E1介导的表达VLDLR或ApoER2iso2的K562细胞的感染。VLDLR或ApoER2的表达对K562细胞的CHIKV、VEEV或WEEVRVP感染没有影响。由于sVLDLRLBD阻断了过表达ApoER2iso2的K562细胞的SFV、EEEV和SINVRVP感染，这表明VLDLR和ApoER2在这些甲型病毒的E2/E1蛋白上结合了一个重叠的位点。
为了证实甲型病毒E2/E1蛋白与VLDLRLBD的相互作用，作者用编码不同甲型病毒E3-E2-6K/TF-E1蛋白的质粒转染HEK293T细胞，并用Fc融合蛋白进行细胞表面染色实验(图3a)。结果表明，VLDLRLBD-Fc结合细胞被SFV、EEEV和SINVE3-E2-6K/TF-E1转染，但没有细胞被CHIKVE3-E2-6K/TF-E1转染(图3a)。相反，Mxra8胞外域(Mxra8ect)-Fc，与转染CHIKVE3-E2-6K/TF-E1的细胞结合(图3a)。
为了搞清楚甲型病毒E2/E1蛋白是否直接与VLDLR和ApoER2的LBD结合，作者生成和纯化了病毒样颗粒（VLP），但用负染电子显微镜检查VLP时，没有观察到相关的脂蛋白。在基于生物层干涉(BLI)的实验中，VLDLRLBD-Fc，捕获了SFV、SINV和EEEVVLP(图3b)。作者还生成了ApoER2iso1LBD-Fc融合蛋白(ApoER2LBDiso1-Fc)。ApoER2LBDiso1-Fc捕获SFV、EEEV和SINVVLP(图3b)。添加RAP，但不是控制蛋白，特异性地阻断了VLP与VLDLRLBD-Fc和ApoER2LBDiso1-Fc的结合(图3b)。因此，VLDLR和ApoER2的LBD直接与甲型病毒E2/E1蛋白相互作用。
接下来，作者转向共聚焦显微镜来确定VLDLR或ApoER2iso2的表达是否允许荧光标记的VLP与细胞表面结合和内化。作者将标记的VLP与同样用肝素酶处理并用小麦胚凝集素(WGA)染色的转导K562细胞孵育，以显示细胞膜(图3c)。VLDLR的表达，促进了标记的SFVVLP与细胞表面膜的结合，在37°C比4°C的细胞质中检测到更多的颗粒，表明内化(图3c，d)。作者还观察到在37°C表达ApoER2iso2的细胞胞浆中SFVVLP的数量增加。VLDLR和ApoER2iso2的表达促进了EEEVVLP的细胞表面结合，并且在37℃表达VLDLR或ApoER2iso2的细胞胞浆中检测到更多的颗粒(图3d)。在表达VLDLR和ApoER2的细胞上检测到SINVVLP的细胞表面结合和内化，但影响的幅度比作者观察到的SFV和EEEVVLP的影响要小(图3d)。
当感染SFVA774株时，新生小鼠会迅速死于暴发性脑炎。因为VLDLR和ApoER2对中枢神经系统的发育很重要，两种受体都缺乏的小鼠会出现共济失调、严重的认知缺陷和早期的白血病。所以，作者使用VLDLRLBD-Fc作为体内研究的阻断剂。该蛋白应该能阻止VLDLR和ApoER2依赖的细胞进入，因为sVLDLRLBD阻断实验表明，甲型病毒E2/E1蛋白使用相同的表面与这两种受体结合。结果表明，VLDLRLBD-Fc在空斑试验中和了SFVA774。10日龄小鼠在接受磷酸盐缓冲盐水或同型对照IgG后6小时接种SFVA774，所有动物在病毒攻击后3天内迅速死亡。然而，在病毒攻击前6小时使用VLDLRLBD-Fc治疗的动物，到遭受病毒攻击后第3天仍然100%存活(图4c，d)。
VLDLR和ApoER2的LBD即使在高度分化的物种中也大多是保守的。作者用不同的VLDLR和ApoER2同源基因转导K562细胞，利用RAP与高度分化的脂蛋白受体同源基因相互作用，而不与外源添加的LDLR相互作用的能力，使用RAP来监测同源基因细胞的表面表达。结果显示，SFVRVP感染表达马(EquusCaballus)和禽类(SturnusCommonGaris)VLDLR同源基因的K562细胞(图4e)。SFV和EEEV感染表达埃及伊蚊和白纹伊蚊VLDLR同源基因(脂蛋白受体1)的细胞(图4e)。值得注意的是，SFVRVP还可以感染过度表达秀丽隐杆线虫（）VLDLR同源基因的细胞，这是一种在调节蠕虫肠道脂质含量方面发挥作用的受体(图4e)。小鼠、马和禽类ApoER2同源基因在不同程度上支持SFV、EEEV和SINVRVP的进入(图4f)。
总结
VEEV最近被证明可以以低密度脂蛋白受体A类结构域3(LDLRAD3)作为受体感染细胞。虽然LDLRAD3A在脊椎动物中被发现，但它在蚊子中没有明显的同源基因。然而，作者测试的每个VLDLR同源基因都支持SFVE2/E1介导的感染，包括线虫的感染，后者与人类有109年的进化分歧(图4e)。此外，在K562细胞上过表达LDLRAD3只促进VEEVRVP的进入，而不是SFV、EEEV和SINVRVP的进入，这表明VEEVE2/E1蛋白进化出只能识别与LDLR家族成员结构同源的蛋白的能力。因此，作者的数据显示，甲型病毒E2/E1蛋白结构的相似性与器官系统受体的结构同源性有关。脂蛋白受体基因家族在多细胞生命来临时出现了一次进化爆发，并在整个进化史中保持了相当程度的保守性。一长串的病毒，包括水泡性口炎病毒、小群鼻炎病毒、A劳斯氏肉瘤病毒，几个黄病毒家族成员，以及最近的VEEV和裂谷热病毒，都被报道与含有LDLR重复序列的受体结合进入细胞。因此，LDLR家族成员可能代表着进化保守的与病原体接触的“热点”。总之，作者的研究在一定程度上帮助回答了一些甲型病毒如何感染范围广泛的生物体这一长期存在的问题。
